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線粒體復合體Ⅰ試劑盒說明書微量法

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                             規格:100/96

線粒體復合體試劑盒說明書

微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

復合體EC 1.6.5. 3)又稱NADH-CoQ 還原酶或NADH脫氫酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中,是線粒體內膜中最大的蛋白復合物。該酶催化一對電子從NADH 傳遞給CoQ,同時可使O2還原生成O2.-,是呼吸電子傳遞鏈上產生O2.-的主要部位。測定該酶活性,不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈(ETC)狀態,而且可以反映活性氧(ROS)生成狀態。

測定原理

復合體能夠催化NADH脫氫生成 NAD+,在340nm下測定NADH的氧化速率計算出該酶活性的大小。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:液體 100mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:液體 20mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:液體 1.5mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑四:液體 25mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑五:液體 1mL×1 支,-20℃保存;

試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存,用時加入2mL蒸餾水,現配現用。

工作液的配制:臨用前將試劑五轉移到試劑四中混合溶解;現配現用;

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g4℃離心 5min

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g4℃離心10min

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體(此步可選做)。

⑤ 步驟中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于復合體酶活性測定。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定

1)工作液于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六,混勻,記錄340nm處初始吸光值A12min 后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2

復合體活力單位的計算

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1)按蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體活力(nmol/min /mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T

=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W×V÷V樣總)

÷T=365×ΔA÷W

3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA

反總:反應體系總體積,2.25×10-4 LεNADH摩爾消光系數,6.22×10L/mol/cmd:比色皿光徑,1cm樣:加入樣本體積,0.01 mL樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2 minW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500 萬。

b.使用 96 孔板測定的計算公式如下:

1)按蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體活力(nmol/min/mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T

=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總)

÷T=730×ΔA÷W

3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體活力(nmol/min/104cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=1.46×ΔA

反總:反應體系總體積,2.25×10-4 LεNADH 摩爾消光系數,6.22×103L/mol/cmd96孔板光徑,0.5cm樣:加入樣本體積,0.01 mL樣總:加入提取液體積,0.202 mL

T:反應時間,2 minW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500 萬。

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